一起來了解一下多肽標記及修飾作用吧

　　目前多肽標記及修飾的內(nèi)容非常多，廣泛應用在多肽藥物，多肽生物學，多肽抗體以及多肽試劑的研究中。目前應用廣泛的有：非放射性核素標記(C13，H2，N15)，熒光標記(FAM，F(xiàn)ITC等)，生物素標記，磷酸化修飾等。

　　1. 非放射性核素標記

　　目前在非放射性核素標記中，使用廣泛的仍然是C13，H2，因為其使用安全，放射性小。現(xiàn)在有比較*的非放射性標記的氨基酸，可以按照正常的多肽合成方法將標記好的氨基酸直接連接到多肽上。

　　2. 熒光標記

　　熒光標記由于沒有放射性，實驗操作簡單。因此，目前在生物學研究中熒光標記應用非常廣泛，熒光標記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對于有游離羧基的采用的方法與接肽反應相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。

　　在N端標記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有后一個氨基酸的去除，但當有一個間隔器如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免。

　　3. 生物素標記

　　生物素-親合素系統(tǒng) (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期應用于免疫學，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應放大系統(tǒng)。

　　由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應，并與熒光素、酶、同位素等免疫標記技術(shù)有機地結(jié)合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進一步提高。

　　主要有用于標記多肽氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)和生物素對硝基酚酯(pBNP)，其中以BNHS常用，當然，也可以直接使用生物素也可以標記，因為其結(jié)構(gòu)上有個游離的羧基，采用HBTU/HOBt/DIEA方法縮合，由于生物素的溶解度低，使用DMSO/DMF的混合溶劑增加溶解度。

　　4. 磷酸肽合成

　　磷酸肽在生命過程中發(fā)揮重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Ser，Thr，Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是單芐基磷酸化氨基酸。

　　磷酸化氨基酸的連接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用該方法合成磷酸化也有缺點，特別是在合成多磷酸化多肽或長肽的時候，連接效率低，后產(chǎn)品純度很低，對于這種磷酸化多肽，我們考慮采用后磷酸化方法，其合成過程就是在多肽合成結(jié)束后，選擇性脫去要標記的氨基酸的側(cè)鏈保護基，對于Tyr，Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護的氨基酸進行反應，而Ser可以采用Fmoc-Ser(trt)，在1% TFA/DCM條件下可以定量的脫除。

　　后磷酸化，采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，隨后在過氧酸下氧化生成磷酰基，完成反應。